Апоптоз кардиомиоцитов

Апоптоз кардиомиоцитов начали изучать лишь в XXI веке. С научно-практической точки зрения проблема апоптоза миокарда даже в конце XX века еще не привлекала внимания исследователей. В самом деле, как можно было проявлять интерес к данной проблеме, если представляется абсурдным сам факт генетически запрограммированной гибели невосполняемых клеток жизненно важного органа. Более того, до недавнего времени существовало мнение о том, что апоптотическая смерть кардиомиоцитов в интактном миокарде вообще не возникает.

Однако использование современных методов исследования апоптоза однозначно свидетельствует о существовании этого процесса в сердце. К настоящему времени получены статистически достоверные научно-практические данные о том, что одним из ведущих механизмов, ответственных за снижение количества жизнеспособных кардиомиоцитов при определенных функциональных состояниях миокарда, является именно их программированная гибель.

Прежде всего, это относится к хронической сердечной недостаточности. Для этой формы патологии характерно перманентное прогрессирующее снижение сократительной способности левого желудочка. Одна из современных рабочих гипотез, объясняющих патогенез хронической сердечной недостаточности, предполагает участие в ее патогенезе апоптотической гибели кардиомиоцитов. Основанием для такой гипотезы явились сведения о наличии в образцах эксцентрично гипертрофированного миокарда большого количества кардиомиоцитов, содержащих деградированную ДНК.

Такие же повреждения, но в меньшем масштабе были обнаружены и в образцах концентрически гипертрофированного миокарда. Поскольку гипертрофия левого желудочка вначале развивается по концентрическому, а затем по эксцентрическому типу, обнаруженные различия в повреждении ДНК объясняли стадийностью развития сердечной недостаточности. Эксцентрическая гипертрофия — это более позднее и, следовательно, более выраженное явление, что и находило свое отражение в большей интенсивности повреждения ДНК.

На основании таких фактов можно было бы предполагать существование прямой зависимости между выраженностью сердечной недостаточности и количеством погибших кардиомиоцитов. Известно, что наиболее четко морфологические признаки апоптоза выявляют с помощью электронной микроскопии Однако исследователям вначале не удалось обнаружить полноценную картину апоптозной деградации клеток (в том числе -ядер кардиомиоцитов) при электронной микроскопии изученных образцов. Вероятно, «классическую» апоптотическую деградацию клеток наблюдали редко и/или она происходила скоротечно.

Обычно апоптозные тельца — фрагменты погибшей клетки исчезают бесследно в среднем за 90 минут. Они фагоцитируются макрофагами или соседними клетками без развития воспалительной реакции. Морфологически регистрируемый процесс апоптоза продолжается 1—3 часа.

В последнее время апоптоз привлекает к себе внимание кардиологов как потенциальный патогенетический фактор не только прогрессирующей хронической сердечной недостаточности, но и многих других форм патологии сердечно-сосудистой системы: коронарного атеросклероза, инфаркта миокарда, крупноочагового постинфарктного кардиосклероза, кардиомиопатий и т.д. Для изучения участия апоптоза в гибели кардиомиоцитов исследуют сердца умерших от кардиоваскулярных форм патологии. Кроме того, широко изучают индуцированный апоптоз кардиомиоцитов у экспериментальных животных (крыс, кроликов, собак) в условиях моделирования таких форм патологии.

Прежде чем анализировать участие апотоза в гибели кардиомиоцитов, рассмотрим современные представления об апоптозе. В настоящее время считают, что апоптоз — это полиэтиологический процесс, т. к. индуцируется многообразными факторами и, вместе с тем, он очевидно монопатогенети-чен, т. е. в целом развивается по единому сценарию независимо от характера вызвавшей его причины. Полиэтиологичность и монопатогенетичность — это основные критерии любого типового патологического процесса. Апоптоз является эволюционно выработанным процессом, т.е. по своей сути защитно-приспособительным. Все такие процессы могут приобретать патогенный характер в определенных, конкретных условиях их возникновения и развития. Биологически активные вещества, участвующие в регуляции апоптоза, как правило, являются белками, а их синтез контролируют соответствующие гены.

К числу генов, стимулирующих апоптоз, относят гены р53, Вах, Bcl-xS. Вместе с тем, известны гены, программирующие синтез белков — ингибиторов апоптоза (Bcl-2, Ced-9, MCL-1 — induced Myeloid Leukemia Cell differentiation protein; MCL-1 — это тот самый белок, который называют «фактором выживания», так как он продлевает срок жизни клеток). Наиболее яркими и информативными белками, отражающими пролиферативные процессы в клетках и тканях, являются белки семейства Вс1-2 (их относят к классу G-белков), которые занимают центральное место в регуляции апоптоза. К настоящему времени известно, что одни белки семейства Вс1-2 являются индукторами апоптоза (Bad, Вах, J3ik, Bid, Bak), а другие — его ингибиторами (Вс1-2, Вс1~Х). Про- и антиапоптозные белки способны объединяться друге другом, формируя гомо- и гетеродимеры. Например, при объединении ингибитора апоптоза белка Вс1-2 с белком-активатором апоптоза Вах итоговый эффект, те. торможение или активация апоптоза, будет определяться тем, какой белок будет преобладать в этом комплексе.

Апоптоз играет большую роль в морфогенезе организма, являясь «инструментом» поддержания гомеостатического баланса между процессами пролиферации и гибели клеток. Это энергозависимый процесс, с помощью которого удаляют «нежелательные» и дефектные клетки организма. Причем данный процесс реализуется очень аккуратно: образующиеся в результате апоптотической гибели клеток т. н. “апоптотические тельца” немедленно фагоцитируются без развития воспаления и повреждения окружающих клеток.

Вообще программируемую клеточную смерть изучают несколько десятилетий. Термин «апоптоз» появился в 1972 г. Первыми исследователями генетических и молекулярных механизмов апоптоза были С. Бреннер, Дж. Салстон и Р. Хорвиц (ученые из Кэмбриджской лаборатории молекулярной биологии). В 2002 г. они были удостоены Нобелевской премии за исследования программируемой клеточной смерти. К настоящему времени установлено, что патогенетически значимая избыточность или недостаточность апоптоза может быть патогенетической основой многих заболеваний Интерес ученых к апоптозу связан прежде всего с возможностью воздействия на него с лечебной целью при аутоиммунных, онкологических и нсй-родегенеративных заболеваниях. За сравнительно короткий отрезок времени установлены основные механизмы реализации апоптоза и регуляторы этого процесса.

Механизмы развития апоптоза

Несмотря на разнообразие этиологических факторов, инициирующих апоптоз, в настоящее время принято выделять два основных варианта трансдукции сигнала апоптоза: рецепторно-зависимый с участием рецепторов гибели клетки и митохондриальный Однако эти пути развития апоптоза не являются строго параллельными, т.е альтернативными друг другу. При современных исследованиях апоптоза выявляют все больше и больше пересечений этих путей, напрааленных на достижение единой конечной цели данного процесса.

Рецепторно-опосредованный путь развития апоптоза

Рецепторно-опосредованный путь развития апоптоза, как правило, начинается с взаимодействия специфических внеклеточных лигандов с рецепторами клеточной гибели, экспрессированными на поверхности клеточной мембраны. Рецепторы, воспринимающие сигнал апоптоза, относятся к суперсемейству TNF-рецепторов. Наиболее изученными рецепторами смерти, для которых описана и определена роль в апоптозе, являются CD95 и TNFRI.

Все рецепторы смерти представляют собой трансмембранные белки. После лиганд-рецепторного взаимодействия экстрацеллюдярные домены таких рецепторов передают сигнал интрацеллюлярным доменам рецепторов смерти, в т.ч. адаптеру для рецептора CD95 (FADD). Адаптер, ассоциированный с рецептором смерти, вступает во взаимодействие с прокаспазами — пока еще не активными предшественниками — членами семейства инициаторньв каспаз. В результате цепочки взаимодействия «лиганд-рецептор-прокаспя за» формируются апоптосомы — агрегаты, которые обеспечивают активациию каспаз.

Митохондриальный путь развития апоптоза

Митохондриальный путь развития апоптоза инициируется повреждением митохондрий, для которого характерно главным образом увеличение проницаемости внутренней мембраны митохондрий вследствие образования в ней гигантских пор. Раскрытие таких пор могут вызывать различные причины, в том числе активные формы кислорода, включая N0, разобщение окислительного фосфорилирования, увеличение содержания Са++ в цитоплазме. Образование пор в митохондриях могут вызывать также каспазы — представители рецепторно-опосредованного пути развития апоптоза. Следствием раскрытия пор являются набухание митохондриального матрикса, разрыв наружной мембраны митохондрий и выход растворимых апоптогенных белков из межмембранного пространства митохондрий в цитоплазму клетки.

В спектр таких белков входят цитохром С, митохондриальный флавопротеин AIF (Apoptoxis Inducing Factor) — индуктор апоптоза, прокаспазы 2,3 и 9.

Высвобождаемый из митохондрий цитохром С совместно с цитоплазматическим фактором APAF-1 (Apoptosis Protease Activating Factor-1 — активирующий фактор апоптотической протеазы-1) образует конструкцию, получившую название апоптосома, которая обеспечивает активацию каспазы 9. Предварительно APAF-1 претерпевает энергозатратные конформационные изменения, благодаря которым приобретает способность связывать цитохром С. Образовавшаяся аполтосома активирует прокаспазу 3 с образованием эффекторной каспазы 3.

Высвобождаемый из митохондрий флавопротеин AIF является эффектором апоптоза, действующим независимо от каспаз.

Итогом программируемой клеточной гибели вне зависимости от изначального инициирующего воздействия являются фрагментация ДНК с участием нуклеаз, а также распад клетки на отдельные апоптотические тельца, ограниченные плазматической мембраной. На внешней стороне мембраны экспрессируются специфические молекулярные маркеры, распознаваемые фагоцитирующими клетками. Таким образом, реализация апоптоза, как правило, обеспечивается интегрированным взаимодействием двух основных сигнальных путей — рецепторзависимого и митохондриального.

 

На сегодняшний день разработано несколько десятков методов выявления и изучения апоптотических клеток in vivo и in vitro. Эти методы базируются на качественной или количественной оценке событий, вызванных изменениями в наружной мембране клеток, избирательной фрагментацией ядерной ДНК, изменениями структуры внутриклеточных компонентов или их перераспределением. Для определения апоптотических клеток, кроме световой и флуоресцентной микроскопии, используют лазерную сканирующую и проточную цитометрию, однофотонную эмиссионную компьютерную томографию, магнитно-резонансную томографию, магнитно-резонансную спектроскопию, позитронно-эмиссионную томографию и т.д.

Результаты подсчета с помощью электронной микроскопии количества апоптотически измененных клеток на полутонком срезе исследуемой ткани выражают в виде так называемого индекса апоптоза (АИ), который на сегодняшний день является «золотым стандартом» оценки апоптоза:

АИ = Количество апоптотических клеток/

Общее количество клеток х 100.

Использование различных методик изучения апоптоза позволило закономерно обнаруживать улътраструктурные дегенеративные изменения кар-дном ионитов у больных кардиомиопатиями, гипертрофией сердца и хронической сердечной недостаточностью. Многочисленными исследованиями установлено повышение интенсивности апоптотических процессов в миокарде левого желудочка при его хронической перегрузке в условиях развития артериальной гипертензии. Увеличение индекса апоптоза обнаружено и в миокарде правого желудочка при повышении гемодинамической нагрузки (преднагрузка объемом) на сердце.

В экспериментах с моделированием артериальной гипертензии выявлена выраженная положительная корреляционная связь между степенью развития гипертрофии миокарда и интенсивностью апоптоза кардиомиоцитов. Предполагают, что фактором, активирующим программированную гибель кардиомиоцитов при гемодинамической перегрузке (постнагрузка давлением или преднагрузка объемом) сердца, являются повышение конечного диастолического объема в желудочках, детерминирующее увеличение степени растяжения кардиомиоцитов. При растяжении стенки желудочков активизируется поступление в кардиомиоциты ионов Са++, стимулирующих каспазный механизм апоптоза.

Активация апоптоза кардиомиоцитов при артериальной гипертензии может быть также обусловлена действием ангиотензина И, образование которого неразрывно связано со стимуляцией локальной кардиальной РААС. Ангиотензин II, который был обнаружен в тканях предсердий человека, реализует свое действие через рецепторы II типа. Этот тип рецепторов находится в экспрессированном состоянии в эмбриональном периоде, но отсутствует в постнатальном. Однако при дисфункции миокарда происходит реэкспрессия этого типа рецепторов к ангиотензину II. Кардиальный ангиотензин II, кроме указанных выше эффектов, способен индуцировать апоптотическую гибель кардиомиоцитов. Установлено, что проапоптогенный эффект ангиотензина-Н может реализоваться за счет его способности стимулировать продукцию Вах-протеина (Вс1-2 ассоциированный Х-протеин), а также образование активных форм кислорода.

В последнее время появились работы, в которых были предприняты попытки определить механизмы, опосредующие взаимосвязь между степенью развития гипертрофии миокарда и интенсивностью апоптоза при экспериментальной артериальной гипертензии.

Определенную роль в стимуляции апоптоза кардиомиоцитов играют SMAD-протеины (SMAD — Similar to Mothers Against Dectapentaplejpc). Это внутриклеточные белки, которые опосредуют сигнализацию от рецептора TGF-pl. Предполагают, что SMAD-протеины являются факторами перехода от компенсаторного гипертрофического роста к сердечной недостаточности.

Высказывается предположение о том, что апоптотическая гибель гипертрофированных кардиомиоцитов может реализовываться за счет некаспат ных механизмов, опосредованных, в частности, апоптозиндуцируюпшм фактором AIF (Apoptosis Inducing Factor); это митохондриальный флавопротеик локализованный между внутренней и наружной мембранами митохондрий При деструкции митохондрий, вызванной активными формами кислорода и ионами кальция, AIF высвобождается из митохондрий, а затем трансто-пируется в ядро. Механизм апоптогенного эффекта AIF состоит в активагш эндонуклеазы, расщепляющей ДНК, что манифестируется конденсацией хроматина и фрагментацией ДНК.

В ряде публикаций обсуждается возможность участия аннексинового механизма в интенсификации апоптоза кардиомиоцитов при гипертоническом поражении сердца. Аннексии А5 (АпхА5) представляет собой Са~+ связывающий протеин, который активируется при воздействии различных апоптотаческих стимулов на кардиомиоциты и другие клетки миокарда. Предполагают, что внутриклеточный аннексии А5 способствует реализации апоптотических процессов за счет влияния на обмен кальция и состояние митохондрий.

В качестве общего фактора, индуцирующего параллельное развитие гипертрофии миокарда и активизацию апоптотических процессов по митохондриальному пути при гемодинамической перегрузке левого желудочка, может также быть оксидативный стресс.

Представляются весьма интересными результаты исследования, в котором различные маркеры апоптоза, в том числе Fas,белки семейста Всl-2, каспазы, определяли в миокарде как при его физиологической (компенсаторной), так и при патологической гипертрофии. Установлено, что повышенную чувствительность к апоптогенным стимулам проявляют только гипертрофированные кардиомиоциты. При этом оказалось, что при патологической гипертрофии проапоптозные изменения выражены в большей степени, чем при физиологической.

Несмотря на то, что в большинстве работ имеются указания на индукцию митохондриального пути апоптогенной сигнальной трансдукции и ее связь с формированием гипертрофии миокарда, в некоторых экспериментах изучали и рецепторно-опосредованный механизм. В частности, in vitro было установлено, что при искусственной стимуляции Fas-рецепторов мышиных кардиомиоцитов развивалась их выраженная гипертрофия, связанная с инактивацией гликогенсинтазы киназы 3-р (GSK3-0).

Интенсивность апоптоза кардиомиоцитов связывают также с адренергической регуляцией. Так, фармакологические исследования in vitro подтвердили, что при стимуляции Pj-адренорецепторов (активация этих рецепторов приводит к повышению минутного объема кровообращения за счет увеличения ударного объема и тахикардии) индуцируется апоптоз кардиомиоцитов, предположительно связанный с цАМФ и кальциевым механизмом. Активация р2-адренорецепторов, напротив, вызывает антиапоптозный эффект. Считают, что p-адренергическая индукция апоптоза реализуется по митохондриальному сигнальному пути, поскольку при снижении проницаемости мембраны митохондрий или активности каспаз уменьшается интенсивность апопшгических процессов, вызванных стимуляцией p-адренорецепторов.

Провоспалительные цитокины TNF-a, IL-ip, IL-6 совместно с активными формами кислорода способны нарушать внутриклеточный обмен Са++. При этом считают, что провоспалительные цитокины в большей степени ответственны за индукцию апоптоза посредством их соединения с мембранными рецепторами (рецепторно-опосредованный путь), тогда как кальциевая перегрузка преимущественно вызывает некротические изменения за счет повреждения митохондрий (митохондриальный путь). Повышенный уровень TNF-a коррелирует с тяжестью проявлений хронической сердечной недостаточности. На сегодняшний день установлено, что противовоспалительные цитокины IL-10, TGF-p ингибируют апоптогенную активность TNF-a в кардиомиоцитах. Аналогичное свойство проявляет фактор SOCS-1 (Suppressor of Cytokine Signaling-1 — супрессор цитокинового сигнала -1). Механизм действия последнего реализуется через модуляцию МАРК (Mitogen-Activate Protein Kinase — митогенакгивируемые протеинкиназы).

В последнее время активно изучают механизмы программированной клеточной гибели кардиомиоцитов и других клеточных элементов миокарда при различных кардиодистрофических процессах, в первую очередь при кардиомиопатиях. Относительно роли апоптоза в динамике морфологических изменений миокарда при дилатационной кардиомиопатии мнения различных авторов расходятся. В более ранних работах отмечали, что нет четких доказательств участия апоптотических механизмов в развитии данной формы патологии. Однако использование современных тонких методов детекции маркеров апоптоза позволило другим исследователям установить обратное.

Апоптоз кардиомиоцитов при гипертрофической и рестриктивной кардиомиопатиях на сегодняшний день остается малоизученным.

Усиление апоптоза кардиомиоцитов наблюдают при многих распространенных формах патологии сердца. Особое внимание при этой уделяют изучению процесса апоптоза в патогенезе хронической сердечной недостаточности. Пока не имеется достаточно убедительных доказательств влияния апоптоза на сократительную активность миокарда. Кроме того, на сегодняшний день недостаточно изучены незавершенные и обратимые формы апоптоза, о существовании которых свидетельствует целый ряд современных научных исследований.

Вместе с тем, к настоящему времени уже появились фармакологические средства, способные эффективно ингибировать апоптоз кардиомиоцитов, индуцированный различными стимулами. Эти средства преимущественно применяют в экспериментальных условиях. Накоплен также определенный опыт их использования в клинической практике. Исходя из современных представлений о механизмах развития апоптоза, основу патогенетической терапии повреждений миокарда, детерминированных активацией апоптоза, составляет блокада (ингибирование) данного процесса на разных стадиях его развития (индукция, трансдукция, транслокация, реализация апоптогенной генетической программы).

Антиапоптогенный эффект может быть также достигнут посредством воздействия на уровне рецепторов. В экспериментах, например, было установлено, что IL-33 предупреждает апоптоз кардиомиоцитов и улучшает функцию сердца у мышей с инфарктом миокарда. IL-33 взаимодействует с мембранным рецептором ST2. ST2 (Growth Slimulation expressed gene t стимулирующий фактор роста, экспрессируемый геном 2) — это член семейства рецепторов IL-1, относится к новейшим маркерам, используемым для прогнозирования риска развития неблагоприятных исходов и летальности пациентов с подтвержденным диагнозом сердечной недостаточности. ST2 экспрессируется в сердце в ответ на патологические изменения, вызванные хроническими заболеваниями сердца и/или его острыми повреждениями, и отражает процессы ремоделирования желудочков сердца.

В клинической практике примером препарата, обладающего свойством ингибировать апопотоз на уровне рецепторов, может быть карведилол. Применение данного официального препарата существенно снижает уровень смертности больных сердечной недостаточностью. В спектре эффектов карведилола выделяют его антиапоптотическое действие, которое основано на подавлении экспрессии миокардиальных Fas-рецепторов и ингибировании SAPK (Stress-Activated Protein Kinase) -протеинкиназы (этот фермент активируется в условиях развития стресса).

Благоприятный антиапоптогенный эффект может быть достигнут применением ингибиторов каспаз. В экспериментальных условиях, например, доказано, что использование хлорометилкетона, способного подавлять активацию каскада каспаз, сокращает зону инфаркта у подопытных кроликов примерно на 30%.

Другой пример – результаты исследования влияния на апоптоз кардиомиоцитов мицеллярной формы изосорбида динитрата — экзогенного донора оксида азота. В опытах на крысах с моделированной коронарной недостаточностью, подвергнутых стрессорному воздействию, введение этого препарата приводило к снижению количества «апоптотических» клеток, уменьшению зоны ишемии по сравнению со стрессовой группой животных. Авторы данного исследования предполагают, что механизмы подавления апоптоза связаны со сложным взаимодействием между белками теплового шока, антиапоптотическими белками Вс1-2, различными каспазами и оксидом азота. Эти исследователи считают, что мицеллярная форма изосорбида динитрата может быть рекомендована для применения в клинической практике с целью ингибирования апоптоза кардиомиоцитов в условиях развития коронарной болезни и сердечной недостаточности.

Совсем недавно было установлено, что некоторые гормональные препараты обладают цитопропгекторным эффектом, основанным на антиапоптозной активности в отношении кардиомиоцитов. В частности, обнаружена способность прогестерона уменьшать апоптотическую гибель кардиомиоцитов за счет активации экспрессии генов, кодирующих синтез Bcl-xL. Анти-апоптогенную активность проявляют кортикостероиды (гидрокортизон, кортизон, альдостерон).

Другим возможным вариантом фармакологического подавления апоптоза кардиомиоцитов является блокада экспрессии «популярного» гена р53.

В заключение отметим, что апоптоз — это эволюционно-выработанный типовой патологический процесс, который при ремоделировании миокарда может иметь как защитно-приспособительное, так и патогенное значение в зависимости от конкретных условий его развития. Активация апоптотической гибели кардиомиоцитов происходит при многих формах нарушения насосной функции сердца, нередко при этом играя роль основного патогенетического фактора, например, при хронической сердечной недостаточности.

К настоящему времени на молекулярном уровне расшифрован целый ряд механизмов апоптотической гибели кардиомиоцитов.